STOP HET PFIZER-VACCINE

De Britse toezichthouder heeft Pfizer / BioNTech op 2 december 2020 goedgekeurd.
Deze beslissing moet worden teruggedraaid. We kunnen een gerechtelijk onderzoek starten.

De redenen voor herziening worden volledig toegelicht in het verzoekschrift aan het Europees Geneesmiddelenbureau dat op 1 december 2020 is ingediend door Dr. Mike Yeadon en Dr. Wolfgang Wodarg.

Hieronder staat de petitie die ze hebben ingediend, het is de belangrijkste wetenschappelijke uitdaging voor de vaccin- en testregimes die sinds januari 2020 zijn ingesteld.

VERZOEKER:                                                                                               1 december 2020

Dr. med. Wolfgang Wodarg

Duitsland

MEDE-AANVRAGER:

Dr. Michael Yeadon

Engeland, CT3 1R

NAAR:

Europees Geneesmiddelenbureau

Comité voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik (CHMP)

COVID-19 EMA Pandemic Task Force (COVID-ETF)

Domenico Scarlattilaan 6

1083 HS Amsterdam

Nederland

[email protected]

[email protected]

!! DRINGEND !!

AANVRAAG / MOTIE VOOR

ADMINISTRATIEVE / REGELGEVENDE MAATREGELEN MET BETREKKING TOT

BEVESTIGING VAN WERKZAAMHEID EINDPUNTEN EN GEBRUIK VAN GEGEVENS IN

VERBINDING MET DE VOLGENDE KLINISCHE PROEF (EN):

FASE III – EUDRACT-NUMMER: 2020-002641-42 SPONSORPROTOCOLNUMMER: C4591001 SPONSOR:

BIONTECH SE (SOCIETAS EUROPAEA), AN DER GOLDGRUBE 12, 55131 MAINZ, DUITSLAND

EN ELKE ANDERE LOPENDE KLINISCHE PROEF MET VACCINEKANDIDATEN DIE ZIJN ONTWORPEN OM DE TRANSMISSIE VAN HET VIRUS VAN DE VACCINE-ONTVANGER NAAR ANDEREN TE STOPPEN EN / OF OM COVID-19 TE VOORKOMEN OF SYMPTOMEN VAN COVID-19 TE VERMINDEREN WAARVOOR PCR-RESULTATEN HET EERSTE BEWIJSMIDDEL ZIJN

MET SARS-COV-2

ADMINISTRATIEF / REGELGEVEND VERBLIJF

Deze petitie voor een verblijf van de maatregel wordt ingediend door de ondergetekende ( “ indiener ” of “ Lead indiener ”) om de EMA een verzoek) blijven de fase III klinische studie (s) van BNT162b (Eudractnummer 2020-002641-42) in de EU (huidig ​​protocolland: Duitsland) totdat de studieopzet is aangepast om te voldoen aan de verzoeken in de sectie “Actie aangevraagd” ( B. ) hieronder; en b) alle andere klinische proeven met vaccinkandidaten die zijn bedoeld om de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin op anderen te stoppen en / of de symptomen van COVID-19 te voorkomen of verminderen, waarvoor PCR-resultaten het primaire bewijs van infectie zijn.

Vanwege de dwingende noodzaak om de veiligheid en werkzaamheid te waarborgen van elk COVID-19-vaccin dat is goedgekeurd door het EMA (en / of het Duitse Paul-Ehrlich-Institut), en om verzoeker de mogelijkheid te bieden om gepaste gerechtelijke noodhulp te zoeken als de EMA weigert zijn verzoekschrift,

Verzoeker verzoekt het EMA respectvol om onmiddellijk actie te ondernemen op het verzoekschrift.

  • BETROKKEN BESLISSINGEN
  • Goedkeuring van het proefontwerp en / of besluit om het proefontwerp voor de fase III-studie van BNT162 niet aan te vechten (EudraCT-nummer 2020-002641-42)
  • Goedkeuring van het onderzoeksontwerp en / of het besluit om het ontwerp van het onderzoek van alle andere klinische onderzoeken met vaccinkandidaten niet aan te vechten, bedoeld om de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin op anderen te stoppen en / of om de symptomen van COVID-19 waarvoor PCR-resultaten zijn te voorkomen of te verminderen zijn het belangrijkste bewijs van infectie.
  • ACTIE GEVRAAGD
  • Verblijf met de fase III-studie van BNT162 in het protocolland Duitsland en in alle andere EU-protocollanden (indien van toepassing) totdat de onderzoeksopzet is gewijzigd om te bepalen dat:

Voordat een noodautorisatie / voorwaardelijke goedkeuring en / of onbeperkte autorisatie wordt afgegeven voor het Pfizer / BioNTech-vaccin, moet de infectiestatus van alle ‘eindpunten’ of COVID-19-gevallen die worden gebruikt om de werkzaamheid van het vaccin in de fase 3- of 2/3-onderzoeken te bepalen, worden bevestigd door geschikte Sanger-sequencing (zoals beschreven in sectie C. III. hieronder), gegeven a) de hoge cyclusdrempels die in sommige onderzoeken worden gebruikt; en b) ontwerpfouten van bepaalde RT-qPCR-tests identiek aan of gemodelleerd naar wat soms de “Drosten-Test” wordt genoemd.

  • Blijf bij de klinische proeven van alle vaccinkandidaten die zijn ontworpen om de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin op anderen te stoppen en / of om de symptomen van COVID-19 te voorkomen of te verminderen, waarvoor PCR-resultaten het primaire bewijs van infectie zijn, totdat de onderzoeksopzet wordt gewijzigd om dat:

Voordat een noodautorisatie / voorwaardelijke goedkeuring en / of onbeperkte autorisatie wordt afgegeven voor een vaccin dat bedoeld is om de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin naar anderen te stoppen en / of om symptomen van COVID-19 te voorkomen of te verminderen, moeten alle ‘eindpunten’ of COVID-19 van de gevallen die worden gebruikt om de werkzaamheid van het vaccin te bepalen, moet de infectiestatus worden bevestigd door een geschikte Sanger-sequencing (zoals beschreven in deel B. III. hieronder), gezien a) de hoge cyclusdrempels die in sommige onderzoeken worden gebruikt; en b) ontwerpfouten van bepaalde RT-qPCR-tests identiek aan of gemodelleerd naar wat soms de “Drosten-Test” wordt genoemd.

  • Er wordt algemeen erkend dat hoge cyclusdrempels, of Ct-waarden, in RT-qPCR-testresultaten leiden tot fout-positieven. Ook heeft een groep wetenschappers en onderzoekers onlangs opgeroepen tot intrekking van het artikel dat de zogenaamde “Drosten-Test” beschrijft (soms ook wel het “Corman-Drosten-protocol” genoemd – een specifieke RT-qPCR-test beschreven door Corman, Victor M., Drosten, Christian en anderen in “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR.” Euro Surveillance 2020; 25 (3): pii = 2000045. Https: // doi .org / 10.2807 / 1560-7917.ES.2020.25.3.2000045).

Alle RT-qPCR-positieve testresultaten die worden gebruikt om de patiënt te categoriseren als ‘COVID-19-gevallen’ in de onderzoeken en die worden gebruikt om de eindpunten van de proef te kwalificeren, moeten worden geverifieerd door Sanger-sequencing om te bevestigen dat de geteste monsters in feite een unieke SARS-CoV- 2 genomisch RNA. Conform de vereisten van de FDA en EMA voor een bevestigde diagnose van humaan papillomavirus (HPV) met behulp van PCR, moet het sequencing-elektroferogram minimaal 100 aaneengesloten basen tonen die overeenkomen met de referentiesequentie met een verwachte waarde (E-waarde) <10-30 voor de specifieke SARS -CoV-2-gensequentie gebaseerd op een BLAST-zoekopdracht in de GenBank-database (ook bekend als NCBI Nucleotide-database).

  • MOTIVERING
  • Zoals hierin uiteengezet, (i) zonder het gevraagde verblijf, zullen indiener en veel EU-ingezetenen / burgers onherstelbare schade lijden, (ii) het verzoek is niet lichtzinnig en wordt te goeder trouw gevolgd, (iii) het verzoek getuigt van gezond openbaar beleid , en (iv) het algemeen belang is voorstander van verblijf.
  • Indiener acht de huidige onderzoeksopzet voor de fase II / III-onderzoeken van BNT162b (“de Pfizer / BioNTech-studie”) ontoereikend om de werkzaamheid nauwkeurig te beoordelen. Indiener is ook van mening dat de opzet van klinische proeven met vaccinkandidaten die bedoeld zijn om de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin op anderen te stoppen en / of om de symptomen van COVID-19, waarvoor de PCR-resultaten het primaire bewijs van infectie zijn, te voorkomen of te verminderen. nauwkeurig de doeltreffendheid beoordelen.
  • Indiener en het publiek zullen onherstelbare schade lijden als de acties waarom hierin wordt verzocht niet worden toegekend, want zodra de EMA (en andere bevoegde instanties in de verschillende EU-lidstaten) de betreffende COVID-19-vaccins goedkeuren, zullen zowel de regeringen van de EU-lidstaten als de werkgevers in de EU zullen ze waarschijnlijk aanbevelen voor wijdverbreid gebruik. Als de toewijzing van gevallen en niet-gevallen tijdens de proeven niet nauwkeurig is, zullen de vaccins niet goed zijn getest. Als de vaccins niet goed worden getest, zullen belangrijke beslissingen van het overheidsbeleid met betrekking tot het gebruik ervan op misleidend bewijs worden gebaseerd. De medische en economische gevolgen voor EU-lidstaten en hun inwoners / burgers kunnen nauwelijks groter zijn.

IV. Bovendien, als de vaccins worden goedgekeurd zonder een passende en nauwkeurige beoordeling van de werkzaamheid, is de mogelijke acceptatie of het mandaat van deze vaccins waarschijnlijk gebaseerd op onnauwkeurig bewijs met betrekking tot het vaccin, namelijk dat het de overdracht van het virus door de ontvanger van het vaccin zal stoppen. aan anderen en / of dat het de ziekte en sterfgevallen door COVID-19 zal verminderen. Het Pfizer / BioNTech-proefprotocol en andere proefprotocollen zijn momenteel niet ontworpen om te bepalen of een van deze doelstellingen kan worden bereikt; en zelfs als dat wel het geval was, als gevallen niet betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd, zou geen van beide doelstellingen op betrouwbare wijze kunnen worden bereikt.

  • Het algemeen belang weegt ook sterk in het voordeel van de gevraagde vrijstelling omdat het verbeteren van de nauwkeurige bepaling van primaire eindpunten (i) in overeenstemming is met de beste wetenschappelijke praktijken, (ii) het vertrouwen van het publiek in de werkzaamheid van een product dat waarschijnlijk verplicht is of bedoeld is voor wijdverbreid gebruik, en (iii) als u dit niet doet, zal dit het tegenovergestelde resultaat hebben en onzekerheden creëren over de werkzaamheid van en de noodzaak van de COVID-19-vaccins.

VI . Indiener neemt hierbij de gronden, feiten, argumenten en meningen op die zijn vermeld in de “VERZOEK OM ADMINISTRATIEVE ACTIE MET BETREKKING TOT BEVESTIGING VAN DE WERKZAAMHEID. via elektronische indiening op 25 november 2020 (bewijsstuk A – Docket nr. FDA-2020-P-2225). Bewijsstuk A bijgevoegd zal hierin worden opgenomen en zal worden beschouwd als een onderdeel hiervan alsof het in de hoofdtekst van dit verzoekschrift is opgenomen.

VII. Verzoeker neemt hierbij ook de gronden, feiten, argumenten en meningen over zoals vermeld in de externe peer review van de “Drosten-Test” (Bijlage B). Ontwerpfouten van bepaalde RT-qPCR-tests die identiek zijn aan of gemodelleerd zijn naar wat soms de “Drosten-Test” wordt genoemd, kunnen leiden tot fout-positieve resultaten in onderzoeken die zo zijn ontworpen dat PCR-resultaten het primaire bewijs van infectie zijn. Bewijsstuk B dat hierbij is bijgevoegd, zal hierin worden opgenomen en zal worden beschouwd als een onderdeel hiervan alsof het is opgenomen in de hoofdtekst van dit verzoekschrift

VIII. Om een ​​vaccin te laten werken, moet ons immuunsysteem worden gestimuleerd om een ​​neutraliserend antilichaam te produceren, in tegenstelling tot een niet-neutraliserend antilichaam. Een neutraliserend antilichaam is een antilichaam dat een gebied (‘epitoop’) van het virus kan herkennen en eraan kan binden, en dat er vervolgens toe leidt dat het virus uw cellen niet binnendringt of zich vermenigvuldigt. Een niet-neutraliserend antilichaam kan zich aan het virus binden, maar om de een of andere reden kan het antilichaam de infectiviteit van het virus niet neutraliseren. Als een persoon bij sommige virussen een niet-neutraliserend antilichaam tegen het virus herbergt, kan een volgende infectie door het virus ervoor zorgen dat die persoon een ernstiger reactie op het virus uitlokt vanwege de aanwezigheid van het niet-neutraliserende antilichaam. Dit geldt niet voor alle virussen, alleen voor bepaalde virussen. Dit wordt Antibody Dependent Enhancement (ADE) genoemd, en is een veelvoorkomend probleem met het Dengue-virus, het ebolavirus, HIV, RSV en de familie van coronavirussen. In feite is dit probleem van ADE een belangrijke reden waarom veel eerdere vaccinonderzoeken voor andere coronavirussen faalden. Bij diermodellen werden grote veiligheidsproblemen waargenomen. Als ADE bij een persoon optreedt, kan hun reactie op het virus erger zijn dan hun reactie als ze nooit een antilichaam hadden ontwikkeld. Dit kan een hyperinflammatoire reactie veroorzaken, een cytokinestorm en een algemene ontregeling van het immuunsysteem waardoor het virus meer schade aan onze longen en andere organen van ons lichaam kan veroorzaken. Bovendien zijn nieuwe celtypen door ons hele lichaam nu vatbaar voor virale infectie vanwege de extra virale toegangsroute. Er zijn veel onderzoeken die aantonen dat ADE een hardnekkig probleem is bij coronavirussen in het algemeen, en in het bijzonder met SARS-gerelateerde virussen. ADE heeft bewezen een serieuze uitdaging te zijn met coronavirusvaccins, en dit is de belangrijkste reden waarom veel van dergelijke vaccins faalden in vroege in-vitro- of dierproeven. Resusapen die waren gevaccineerd met het Spike-eiwit van het SARS-CoV-virus vertoonden bijvoorbeeld ernstige acute longbeschadiging bij provocatie met SARS-CoV, terwijl niet-gevaccineerde apen dat niet deden. Evenzo vertoonden muizen die waren geïmmuniseerd met een van de vier verschillende SARS-CoV-vaccins histopathologische veranderingen in de longen met eosinofieleninfiltratie nadat ze waren blootgesteld aan resusapen die waren gevaccineerd met het Spike-eiwit van het SARS-CoV-virus vertoonden ernstige acute longbeschadiging bij provocatie met SARS-CoV, terwijl niet-gevaccineerde apen dat niet deden. Evenzo vertoonden muizen die waren geïmmuniseerd met een van de vier verschillende SARS-CoV-vaccins histopathologische veranderingen in de longen met eosinofieleninfiltratie nadat ze waren blootgesteld aan resusapen die waren gevaccineerd met het Spike-eiwit van het SARS-CoV-virus vertoonden ernstige acute longbeschadiging bij provocatie met SARS-CoV, terwijl niet-gevaccineerde apen dat niet deden. Evenzo vertoonden muizen die waren geïmmuniseerd met een van de vier verschillende SARS-CoV-vaccins histopathologische veranderingen in de longen met eosinofieleninfiltratie nadat ze waren blootgesteld aan

IX. Er zijn enkele zorgwekkende problemen met de proefontwerpen, uiteengezet door Dr. Peter Doshi in het British Medical Journal. Dr. Doshi concentreert zich op de twee grootste problemen. Ten eerste is geen van de toonaangevende vaccinkandidaatonderzoeken bedoeld om te testen of het vaccin ernstige COVID-19-symptomen kan verminderen, gedefinieerd als: ziekenhuisopname, ICU of overlijden. En ten tweede zijn de proeven niet bedoeld om te testen of het vaccin de overdracht kan onderbreken (https://www.bmj.com/content/bmj/371/bmj.m4037.full.pdf). Als aan geen van deze voorwaarden is voldaan, werkt het vaccin in wezen als een therapeutisch medicijn, behalve dat een vaccin profylactisch wordt ingenomen, zelfs door de volkomen gezonde mensen, en meer dan waarschijnlijk een hoger risico op letsel met zich meebrengt dan een therapeutisch medicijn. Als dit waar zou zijn, dan zouden therapeutische medicijnen superieur zijn aan elk COVID-vaccin.

X . In de Pfizer / BioNTech mRNA-vaccinkandidaat wordt polyethyleenglycol (PEG) aangetroffen in de vette lipide-nanodeeltjescoating rond het mRNA. Zeventig procent van de mensen maakt antistoffen aan tegen PEG en de meesten weten het niet, waardoor een zorgwekkende situatie ontstaat waarin velen allergische, mogelijk dodelijke reacties kunnen krijgen op een PEG-bevattend vaccin. PEG-antilichamen kunnen ook de effectiviteit van het vaccin verminderen. Pfizer / BioNTech voegt ook een ingrediënt toe dat is afgeleid van een ongewervelde zeedier, mNeonGreen, in zijn vaccin. Het ingrediënt heeft bioluminescente eigenschappen, waardoor het aantrekkelijk is voor medische beeldvormingsdoeleinden, maar het is onduidelijk waarom een ​​geïnjecteerd vaccin die kwaliteit zou moeten hebben. mNeonGreen heeft onbekende antigeniciteit.

XI. Van verschillende vaccinkandidaten wordt verwacht dat ze de vorming van humorale antilichamen tegen spike-eiwitten van SARS-CoV-2 induceren. Syncytin-1 (zie Gallaher, B., “Response to nCoV2019 Against Backdrop of Endogenous Retroviruses” – http://virological.org/t/response-to-ncov2019-against-backdrop-of-endogenous-retroviruses/396), dat is afgeleid van menselijke endogene retrovirussen (HERV) en verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van een placenta bij zoogdieren en mensen en daarom een ​​essentiële voorwaarde is voor een succesvolle zwangerschap, wordt ook in homologe vorm aangetroffen in de spike-eiwitten van SARS-virussen. Er is geen indicatie of antilichamen tegen spike-eiwitten van SARS-virussen ook zouden werken als anti-Syncytin-1-antilichamen. Echter, als dit het geval zou zijn, zou dit ook de vorming van een placenta voorkomen, wat ertoe zou leiden dat gevaccineerde vrouwen in wezen onvruchtbaar worden. Voor zover ik weet, heeft Pfizer / BioNTech nog geen monsters van geschreven materiaal vrijgegeven dat aan patiënten is verstrekt, dus het is onduidelijk welke informatie, indien aanwezig, over (potentiële) vruchtbaarheidsspecifieke risico’s veroorzaakt door antilichamen is opgenomen.

Volgens sectie 10.4.2 van het Pfizer / BioNTech-onderzoeksprotocol komt een vrouw in de vruchtbare leeftijd (WOCBP) in aanmerking om deel te nemen als ze niet zwanger is of borstvoeding geeft, en tijdens de interventie een aanvaardbare anticonceptiemethode gebruikt zoals beschreven in het onderzoeksprotocol periode (gedurende minimaal 28 dagen na de laatste dosis onderzoeksinterventie).

Dit betekent dat het relatief lang kan duren voordat een merkbaar aantal gevallen van onvruchtbaarheid na vaccinatie kon worden waargenomen.

XII. Het lijkt erop dat Pfizer / BioNTech nog geen monsters heeft vrijgegeven van schriftelijk materiaal dat aan patiënten is verstrekt, dus het is onduidelijk welke instructies / informatie patiënten / proefpersonen kregen met betrekking tot ADE- en PEG-gerelateerde kwesties en (mogelijke) vruchtbaarheid of zwangerschapsspecifieke problemen.

  • BLIJF DRINGEND VEREIST
  • Veel EU-ingezetenen / -burgers van indiener zullen onherstelbare schade lijden, want zodra de EMA het COVID-19-vaccin (en) in kwestie goedkeurt, zullen zowel de regeringen van de EU-lidstaten als de werkgevers in de EU deze waarschijnlijk aanbevelen voor wijdverbreid gebruik, en dus zonder de EMA zorgen voor adequate veiligheid proeven van de vaccins nu , indiener en anderen zullen niet de mogelijkheid om bezwaar te ontvangen van het vaccin gebaseerd op een tekort van klinische proeven later .
  • Bovendien, als de vaccins een vergunning krijgen zonder een passende beoordeling van de werkzaamheid en zonder de nauwkeurige bepaling van de primaire eindpunten te verbeteren, dan is elke mogelijke acceptatie of mandaat van deze vaccins waarschijnlijk gebaseerd op onnauwkeurige overtuigingen en gegevens over de vaccins, namelijk dat ze of de overdracht van het virus van de ontvanger van het vaccin naar anderen kan stoppen en / of dat het de ernstige ziekte en sterfgevallen van COVID-19 zal verminderen. De betreffende proefprotocollen zijn momenteel niet goed ontworpen om te bepalen of een van deze doelstellingen kan worden bereikt.

III . Deze petitie is ook niet lichtzinnig en wordt te goeder trouw nagestreefd omdat het de wetenschappelijke integriteit en betrouwbaarheid van de proeven met de COVID-19-vaccins wil vergroten.

IV . Ten slotte weegt het algemeen belang ook sterk in het voordeel van de gevraagde vrijstelling omdat het verbeteren van de nauwkeurige bepaling van primaire eindpunten (i) in overeenstemming zal zijn met de beste wetenschappelijke praktijken, (ii) het vertrouwen van het publiek in de werkzaamheid van een vaccin dat naar verwachting verplicht zal worden gesteld of sterk aanbevolen voor wijdverbreid gebruik, en (iii) als u dit niet doet, zal dit het tegenovergestelde resultaat hebben doordat het onzekerheden zal creëren over de werkzaamheid van en de noodzaak van de COVID-19-vaccins.

  • Verzoeker dringt er dan ook respectvol op aan dat dit verzoek onmiddellijk wordt ingewilligd. Met respect ingediend namens mij en namens medeverzoeker Dr.Michael Yeadon:

__________________________________________________________

Dr. med. Wolfgang Wodarg

Externe peer review van de RTPCR-test om SARS-CoV-2 op te sporen, onthult 10 belangrijke wetenschappelijke tekortkomingen op moleculair en methodologisch niveau: gevolgen voor vals-positieve resultaten.

Pieter Borger (1) , Bobby Rajesh Malhotra (2) , Michael Yeadon (3) , Clare Craig (4) , Kevin McKernan (5) , Klaus Steger (6) , Paul McSheehy (7) , Lidiya Angelova (8) , Fabio Franchi (9) , Thomas Binder (10) , Henrik Ullrich (11) , Makoto Ohashi (12) , Stefano Scoglio (13) , Marjolein Doesburg-van Kleffens (14) , Dorothea Gilbert (15) , Rainer Klement (16) , Ruth Schruefer (17) , Berber W.Pieksma (18), Jan Bonte (19) , Bruno H. Dalle Carbonare (20) , Kevin P. Corbett (21) , Ulrike Kämmerer (22)

ABSTRACT

In de publicatie getiteld “Detectie van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) door realtime RT-PCR” (Eurosurveillance 25 (8) 2020) presenteren de auteurs een diagnostische workflow en een RT-qPCR-protocol voor detectie en diagnostiek van 2019-nCoV (nu bekend als SARS-CoV-2), waarvan ze beweren dat ze gevalideerd zijn, en dat het een robuuste diagnostische methodologie is voor gebruik in laboratoriumomgevingen voor de volksgezondheid.

In het licht van alle gevolgen van deze publicatie voor samenlevingen wereldwijd, voerde een groep onafhankelijke onderzoekers een puntsgewijze beoordeling uit van de bovengenoemde publicatie waarin 1) alle componenten van het gepresenteerde testontwerp werden gekruist, 2) de RT-qPCR-protocolaanbevelingen werden beoordeeld op basis van goede laboratoriumpraktijken en 3) parameters werden onderzocht aan de hand van relevante wetenschappelijke literatuur over het veld.

Het gepubliceerde RT-qPCR-protocol voor detectie en diagnostiek van 2019-nCoV en het manuscript lijdt aan tal van technische en wetenschappelijke fouten, waaronder onvoldoende primerontwerp, een problematisch en onvoldoende RT-qPCR-protocol en het ontbreken van een nauwkeurige testvalidatie. Noch de gepresenteerde test, noch het manuscript zelf voldoet aan de vereisten voor een acceptabele wetenschappelijke publicatie. Verder worden ernstige belangenconflicten van de auteurs niet genoemd. Ten slotte betekent het zeer korte tijdsbestek tussen indiening en acceptatie van de publicatie (24 uur) dat een systematisch peer review-proces hier ofwel niet werd uitgevoerd, ofwel van problematisch slechte kwaliteit. We leveren overtuigend bewijs van verschillende wetenschappelijke tekortkomingen, fouten en gebreken.

Gezien de wetenschappelijke en methodologische onvolkomenheden die hier worden gepresenteerd, zijn we ervan overtuigd dat de redactie van Eurosurveillance geen andere keuze heeft dan de publicatie in te trekken.

BEKNOPT BEOORDELINGSRAPPORT

Dit artikel zal talrijke ernstige tekortkomingen in het artikel van Corman-Drosten laten zien, waarvan de betekenis heeft geleid tot een wereldwijde verkeerde diagnose van infecties die worden toegeschreven aan SARS-CoV-2 en die verband houden met de ziekte COVID-19. We worden geconfronteerd met strenge lockdowns die het leven en de bestaansmiddelen van veel mensen hebben vernietigd, beperkte toegang tot onderwijs en deze opgelegde beperkingen door regeringen over de hele wereld zijn een directe aanval op de basisrechten van mensen en hun persoonlijke vrijheden, resulterend in bijkomende schade voor hele economieën op een wereldwijde schaal.

Er zijn tien fatale problemen met de Corman-Drosten-paper die we in de volgende secties meer in detail zullen beschrijven en uitleggen.

Het eerste en belangrijkste probleem is dat het nieuwe Coronavirus SARS-CoV-2 (in de publicatie genaamd 2019-nCoV en in februari 2020 door een internationaal consortium van virusdeskundigen SARS-CoV-2 genoemd) is gebaseerd op in silico (theoretische) sequenties , geleverd door een laboratorium in China [1], omdat destijds noch controlemateriaal van besmettelijk (“levend”) of geïnactiveerd SARS-CoV-2 noch geïsoleerd genomisch RNA van het virus beschikbaar was voor de auteurs. Tot op heden is er geen validatie uitgevoerd door het auteurschap op basis van geïsoleerde SARS-CoV-2-virussen of RNA met volledige lengte daarvan. Volgens Corman et al .:

“We wilden een robuuste diagnostische methodologie ontwikkelen en implementeren voor gebruik in openbare gezondheidslaboratoria zonder dat er virusmateriaal beschikbaar is.” [1]

De focus moet hier worden gelegd op de twee genoemde doelen: a) ontwikkeling en b) toepassing van een diagnostische test voor gebruik in laboratoria voor de volksgezondheid . Deze doelen kunnen niet worden bereikt zonder dat er daadwerkelijk virusmateriaal beschikbaar is (bijvoorbeeld voor het bepalen van de infectieuze viral load). In elk geval kan alleen een protocol met maximale nauwkeurigheid het verplichte en primaire doel zijn in een scenario-uitkomst van deze omvang. Het bepalen van de kritische viral load is verplichte informatie en het is de verantwoordelijkheid van Christian Drosten om deze experimenten uit te voeren en de cruciale gegevens te verstrekken.

Niettemin werden deze in silico-sequenties gebruikt om een ​​RT-PCR-testmethodologie te ontwikkelen om het bovengenoemde virus te identificeren. Dit model was gebaseerd op de aanname dat het nieuwe virus sterk lijkt op SARS-CoV uit 2003, aangezien beide bèta-coronavirussen zijn.

De PCR-test is daarom ontworpen met behulp van de genomische sequentie van SARS-CoV als controlemateriaal voor de Sarbeco-component; we weten dit uit onze persoonlijke e-mailcommunicatie met [2] een van de co-auteurs van de Corman-Drosten-paper. Deze methode om SARS-CoV-2 te modelleren werd als volgt beschreven in het Corman-Drosten-document:

“ Het opzetten en valideren van een diagnostische workflow voor 2019-nCoV- screening en specifieke bevestiging, ontworpen in afwezigheid van beschikbare virusisolaten of originele patiëntspecimens. Ontwerp en validatie werden mogelijk gemaakt door de nauwe genetische verwantschap met de SARS-CoV uit 2003, en geholpen door het gebruik van synthetische nucleïnezuurtechnologie. “

De Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) is een belangrijke biomoleculaire technologie om snel zeldzame RNA-fragmenten te detecteren, die van tevoren bekend zijn. In de eerste stap worden RNA-moleculen die in het monster aanwezig zijn, omgekeerd getranscribeerd om cDNA op te leveren. Het cDNA wordt vervolgens geamplificeerd in de polymerasekettingreactie met behulp van een specifiek primerpaar en een thermostabiel DNA-polymerase-enzym. De technologie is zeer gevoelig en de detectielimiet is theoretisch 1 molecule cDNA. De specificiteit van de PCR wordt sterk beïnvloed door biomoleculaire ontwerpfouten.

Wat is belangrijk bij het ontwerpen van een RT-PCR-test en de kwantitatieve RT-qPCR-test beschreven in de Corman-Drosten-publicatie?

1. De primers en sondes:

a) de concentratie van primers en probes moet van een optimaal bereik zijn
(100-200 nM)
b) moet specifiek zijn voor het doelgen dat u wilt amplificeren
c) moet een optimaal percentage GC-gehalte hebben ten opzichte van de totale stikstofbasen ( minimaal 40%, maximaal 60%)
d) voor virusdiagnostiek moeten minimaal 3 primerparen 3 virale genen detecteren (bij voorkeur zo ver mogelijk uit elkaar in het virale genoom)

2. De temperatuur waarop alle reacties plaatsvinden:

a) DNA-smelttemperatuur (> 92 °)
b) DNA-amplificatietemperatuur (TaqPol-specifiek)
c) Tm; de uitgloeitemperatuur (de temperatuur waarbij de primers en sondes de beoogde binding / loslating bereiken, niet hoger dan 2 ° C per primerpaar). Tm is sterk afhankelijk van GC-gehalte van de primers

3. Het aantal amplificatiecycli (minder dan 35; bij voorkeur 25-30 cycli);

In het geval van virusdetectie, detecteert> 35 cycli alleen signalen die niet correleren met infectieus virus zoals bepaald door isolatie in celkweek [besproken in 2]; als iemand door PCR als positief wordt getest wanneer een drempel van 35 cycli of hoger wordt gebruikt (zoals het geval is in de meeste laboratoria in Europa en de VS), is de kans dat die persoon daadwerkelijk is geïnfecteerd minder dan 3%, de kans dat genoemd resultaat is een vals-positief is 97% [beoordeeld in 3]

4. Moleculair biologische validaties; geamplificeerde PCR-producten moeten worden gevalideerd door de producten in een gel te laten lopen met een DNA-liniaal of door directe DNA-sequentiebepaling
5. Positieve en negatieve controles moeten worden gespecificeerd om specifieke virusdetectie te bevestigen / weerleggen
6. Er moet een Standard Operational Procedure (SOP) beschikbaar zijn

SOP specificeert de bovenstaande parameters ondubbelzinnig, zodat alle laboratoria exact dezelfde testomstandigheden kunnen opzetten. Het hebben van een gevalideerde universele SOP is essentieel, omdat het de vergelijking van gegevens binnen en tussen landen mogelijk maakt.

KLEINE ZORGEN MET HET CORMAN-DROSTEN PAPIER

1. In tabel 1 van het Corman-Drosten-document worden verschillende afkortingen vermeld – “nM” is gespecificeerd, “nm” niet. Verder met betrekking tot de juiste nomenclatuur, betekent nm “nanometer”, daarom moet nm hier nM aangeven.

2. Het is de algemene consensus om genetische sequenties altijd in de 5′-3′-richting te schrijven, inclusief de reverse primers. Het is hoogst ongebruikelijk om uitlijning uit te voeren met omgekeerd complementair schrijven van de primersequentie, zoals de auteurs deden in figuur 2 van het Corman-Drosten-artikel. Hier wordt bovendien een wiebelende basis gemarkeerd als “y” zonder beschrijving van de bases waar de Y voor staat.

3. Twee misleidende valkuilen in het Corman-Drosten-artikel zijn dat hun Tabel 1 geen Tm-waarden (annealing-temperatuurwaarden) bevat, noch GC-waarden (aantal G en C in de sequenties als% -waarde van totale bases).

GROTE ZORGEN MET HET CORMAN-DROSTEN PAPIER

EEN ACHTERGROND

De auteurs introduceren de achtergrond voor hun wetenschappelijke werk als: “De aanhoudende uitbraak van het recent opgekomen nieuwe coronavirus (2019-nCoV) vormt een uitdaging voor volksgezondheidslaboratoria, aangezien virusisolaten niet beschikbaar zijn terwijl er steeds meer aanwijzingen zijn dat de uitbraak meer wijdverspreid is dan aanvankelijk gedacht, en internationale verspreiding via reizigers komt al voor ”.

Volgens BBC News [4] en Google Statistics [5] waren er op 21 januari 2020, de dag waarop het manuscript werd ingediend, wereldwijd 6 doden. Waarom gingen de auteurs een uitdaging aan voor laboratoria voor de volksgezondheid, terwijl er op dat moment geen substantieel bewijs was dat de uitbraak meer wijdverspreid was dan aanvankelijk werd gedacht?

Als doel verklaarden de auteurs robuuste diagnostische methodologie te ontwikkelen en in te zetten voor gebruik in openbare gezondheidslaboratoria zonder dat er virusmateriaal beschikbaar is. Verder erkennen ze dat “de huidige studie de enorme responscapaciteit aantoont die is bereikt door coördinatie van academische en openbare laboratoria in nationale en Europese onderzoeksnetwerken.”

B) METHODEN EN RESULTATEN

1. Primer & Probe-ontwerp
1a) Foutieve primerconcentraties

Betrouwbare en nauwkeurige PCR-testprotocollen worden normaliter ontworpen met gebruik van tussen 100 nM en 200 nM per primer [7]. In het Corman-Drosten-document zien we ongewoon hoge en variërende primerconcentraties voor verschillende primers (tabel 1). Voor de RdRp_SARSr-F en RdRp_SARSr-R primerparen worden respectievelijk 600 nM en 800 nM beschreven. Evenzo adviseren ze voor de N_Sarbeco_F en N_Sarbeco_R primerset respectievelijk 600 nM en 800 nM [1].

Het moge duidelijk zijn dat deze concentraties veel te hoog zijn om optimaal te zijn voor specifieke amplificaties van doelwitgenen. Er bestaat geen gespecificeerde reden om deze extreem hoge concentraties primers in dit protocol te gebruiken. Deze concentraties leiden eerder tot verhoogde niet-specifieke binding en PCR-productamplificatie.

Tabel 1: Primers en sondes (aangepast van Corman-Drosten-papier; foutieve primerconcentraties worden gemarkeerd)

1b) Niet-gespecificeerde (“wiebelige”) primer- en probesequenties

Om reproduceerbare en vergelijkbare resultaten te verkrijgen, is het essentieel om de primerparen duidelijk te definiëren. In het Corman-Drosten-artikel hebben we zes niet-gespecificeerde posities waargenomen, aangegeven door de letters R, W, M en S (tabel 2). De letter W betekent dat er op deze positie een A of een T kan zijn; R betekent dat er een G of een A kan zijn; M geeft aan dat de positie een A of een C kan zijn; de letter S geeft aan dat er op deze positie een G of een C kan staan.

Dit grote aantal varianten is niet alleen ongebruikelijk, maar ook zeer verwarrend voor laboratoria. Deze zes niet-gespecificeerde posities zouden gemakkelijk kunnen resulteren in het ontwerp van verschillende alternatieve primersequenties die geen betrekking hebben op SARS-CoV-2 (2 verschillende RdRp_SARSr_F-primers + 8 verschillende RdRp_SARS_P1-probes + 4 verschillende RdRp_SARSr_R).De ontwerpvariaties zullen onvermijdelijk leiden tot resultaten die niet eens SARS CoV-2-gerelateerd zijn. Daarom is de verwarrende, niet-specifieke beschrijving in het Corman-Drosten-artikel niet geschikt als een standaard operationeel protocol. Deze niet-gespecificeerde posities hadden ondubbelzinnig moeten zijn ontworpen.

Deze wiebelige sequenties hebben al een bron van zorg in het veld veroorzaakt en hebben geresulteerd in een brief aan de redacteur, geschreven door Pillonel et al. [8] met betrekking tot flagrante fouten in de beschreven sequenties. Deze fouten zijn vanzelfsprekend in de Corman et al. supplement ook.

Tabel 2: Primers en probes (overgenomen van Corman-Drosten-papier; niet-gespecificeerde (“wiebelige”) nucleotiden in de primers zijn gemarkeerd)

Het WHO-protocol (Figuur 1), dat rechtstreeks is afgeleid van de Corman-Drosten-paper, concludeert dat om de aanwezigheid van SARS-CoV-2 te bevestigen, twee controlegenen (de E- en de RdRp-genen) geïdentificeerd moeten worden. in de test. Opgemerkt moet worden dat het RdPd-gen één onzekere positie (“wiebelig”) heeft in de forward-primer (R = G / A), twee onzekere posities in de reverse-primer (R = G / A; S = G / C) en het heeft drie onzekere posities in de RdRp-sonde (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Er kunnen dus twee verschillende voorwaartse primers, vier verschillende omgekeerde primers en acht verschillende probes worden gesynthetiseerd voor het RdPd-gen. Samen zijn er 64 mogelijke combinaties van primers en probes!

Het Corman-Drosten-artikel identificeert verder een derde gen dat, volgens het WHO-protocol, niet verder werd gevalideerd en onnodig werd geacht:

“Merk op dat de N-genassay ook goed presteerde, maar niet werd onderworpen aan intensieve verdere validatie omdat deze iets minder gevoelig was.”

Dit was een ongelukkige omissie, aangezien het het beste zou zijn om alle drie de gen-PCR’s te gebruiken als bevestigende assays, en dit zou hebben geresulteerd in een bijna toereikend protocol voor het detecteren van virus-RNA-detectie. Drie bevestigende assay-stappen zouden op zijn minst fouten en onzekerheden bij elke stap met betrekking tot “Wankele” -spots minimaliseren. (Desalniettemin zou het protocol nog steeds niet voldoen aan enige “goede laboratoriumpraktijk”, als alle andere ontwerpfouten worden meegerekend).

Zoals het er nu uitziet, wordt de N-genassay helaas niet voorgesteld in de WHO-aanbeveling (Figuur 1) als een verplichte en cruciale derde bevestigingsstap, noch wordt het benadrukt in het Corman-Drosten-document als een belangrijke optionele geruststelling “voor een routinematige workflow” (Tafel 2).

Bijgevolg werden in bijna alle testprocedures wereldwijd slechts 2 primer-matches gebruikt in plaats van alle drie. Dit toezicht maakt het hele testprotocol onbruikbaar met betrekking tot het leveren van nauwkeurige testresultaten die echt van belang zijn in een aanhoudende pandemie.

Figuur 1: De N-Gene-bevestigingstest wordt in de officiële WHO Drosten-Corman-protocolaanbeveling hieronder [8] niet benadrukt als noodzakelijke derde stap en is ook niet vereist als cruciale stap voor een hogere testnauwkeurigheid in de Eurosurveillance-publicatie.

1c) Foutieve GC-inhoud (besproken in 2c, samen met gloeitemperatuur (Tm))
1d) Detectie van virale genen

RT-PCR wordt niet aanbevolen voor primaire diagnostiek van infectie. Dit is de reden waarom de RT-PCR-test die in de klinische routine wordt gebruikt voor de detectie van COVID-19 niet is geïndiceerd voor COVID-19-diagnose op basis van regelgeving.

“Artsen moeten de verbeterde nauwkeurigheid en snelheid van de moleculaire diagnostische technieken voor de diagnose van infecties erkennen, maar ook hun beperkingen begrijpen. Laboratoriumresultaten moeten altijd worden geïnterpreteerd in de context van de klinische presentatie van de patiënt, en de juiste locatie, kwaliteit en timing van de monsterafname zijn vereist voor betrouwbare testresultaten ”. [9]

Het kan echter worden gebruikt om de differentiële diagnose van de arts te helpen wanneer hij of zij onderscheid moet maken tussen verschillende longinfecties (griep, Covid-19 en SARS hebben zeer vergelijkbare symptomen). Voor een bevestigende diagnose van een specifiek virus moeten ten minste 3 specifieke primerparen worden toegepast om 3 virusspecifieke genen te detecteren. Deze doelwitgenen moeten bij voorkeur met de grootst mogelijke afstand in het virale genoom worden gelokaliseerd (inclusief tegenoverliggende uiteinden).

Hoewel het Corman-Drosten-artikel 3 primers beschrijft, beslaan deze primers slechts ongeveer de helft van het virusgenoom. Dit is een andere factor die de specificiteit voor detectie van intact COVID-19-virus-RNA verlaagt en het aantal vals-positieve testresultaten verhoogt.

Daarom, zelfs als we drie positieve signalen verkrijgen (dwz de drie primerparen geven 3 verschillende amplificatieproducten) in een monster, bewijst dit niet de aanwezigheid van een virus. Een beter primerontwerp zou terminale primers aan beide uiteinden van het virale genoom hebben. Dit komt doordat het hele virale genoom bedekt zou zijn en drie positieve signalen een beter onderscheid kunnen maken tussen een compleet (en dus potentieel infectieus) virus en gefragmenteerde virale genomen (zonder infectieuze potentie).Om iets van betekenis af te leiden over de besmettelijkheid van het virus, had het Orf1-gen, dat codeert voor het essentiële replicase-enzym van SARS-CoV-virussen, als doelwit moeten worden opgenomen (Figuur 2). De positionering van de doelen in het gebied van het virale genoom dat het zwaarst en variabelst wordt getranscribeerd, is een andere zwakte van het protocol.

Kim et al. demonstreren een zeer variabele 3′-expressie van subgenomisch RNA in Sars-CoV-2 [23]. Deze RNA’s worden actief gevolgd als handtekening voor asymptomatische en niet-infectieuze patiënten [10]. Het is zeer twijfelachtig om een ​​populatie van asymptomatische mensen te screenen met qPCR-primers die 6 basenparen primer-dimeer hebben op het 3 primaire uiteinde van een primer (Figuur 3).
Blijkbaar beveelt de WHO deze primers aan. We hebben alle wiebelderivaten van het Corman-Drosten-papier getest met de primer-dimeerwebtool van Thermofisher [11]. De RdRp-voorwaartse primer heeft 6bp 3prime-homologie met Sarbeco E Reverse. Bij hoge primerconcentraties is dit voldoende om onnauwkeurigheden te creëren.

Let op: er is een perfecte match van een van de N-primers met een klinische ziekteverwekker (Pantoea), aangetroffen bij immuungecompromitteerde patiënten. De omgekeerde primer treft Pantoea ook, maar niet in dezelfde regio (Figuur 3).

Dit zijn ernstige ontwerpfouten, aangezien de test geen onderscheid kan maken tussen het hele virus en virale fragmenten. De test kan niet worden gebruikt als diagnose voor SARS-virussen.

Figuur 2: Relatieve posities van amplicondoelen op het SARS-coronavirus en het nieuwe coronavirusgenoom uit 2019. ORF: open leeskader; RdRp: RNA-afhankelijke RNA-polymerase. Getallen onder amplicon zijn genoomposities volgens SARS-CoV, NC_004718 [1];

Figuur 3: Een test met Thermofischer’s primer dimeer web tool laat zien dat de RdRp forward primer een 6 bp 3` primer homologie heeft met Sarbeco E Reverse (linkerkader). Een andere test laat zien dat er een perfecte match is voor een van de N-primers met een klinische pathogeen (Pantoea) die wordt aangetroffen bij immuungecompromitteerde patiënten (rechter kader).

2. Reactietemperaturen
2a) DNA-smelttemperatuur (> 92 °).

Voldoende geadresseerd in de Corman-Drosten-paper.

2b) DNA-amplificatietemperatuur.

Voldoende geadresseerd in de Corman-Drosten-paper.

2c) Foutieve GC-inhoud en Tm

De annealing-temperatuur bepaalt bij welke temperatuur de primer hecht / loskomt van de doelsequentie. Voor een efficiënte en specifieke amplificatie moet het GC-gehalte van primers minimaal 40% en maximaal 60% amplificatie bedragen. Zoals aangegeven in tabel 3, vallen drie van de primers beschreven in het Corman-Drosten-papier niet binnen het normale bereik voor GC-gehalte. Twee primers (RdRp_SARSr_F en RdRp_SARSr_R) hebben ongebruikelijke en zeer lage GC-waarden van 28% -31% voor alle mogelijke varianten van wiebelende basen, terwijl primer E_Sarbeco_F een GC-waarde heeft van 34,6% (Tabel 3 en tweede paneel van Tabel 3) .

Opgemerkt moet worden dat het GC-gehalte grotendeels de binding aan zijn specifieke doelwit bepaalt vanwege de drie waterstofbruggen in basenparing. Dus hoe lager het GC-gehalte van de primer, hoe lager het bindingsvermogen aan zijn specifieke doelgensequentie (dwz het te detecteren gen). Dit betekent dat voor een doelsequentie om te worden herkend, we een temperatuur moeten kiezen die zo dicht mogelijk bij de werkelijke uitgloeitemperatuur (best practice-waarde) ligt, zodat de primer niet weer loskomt, terwijl we tegelijkertijd specifiek de doelsequentie.

Als de Tm-waarde erg laag is, zoals waargenomen voor alle wankele varianten van de RdRp reverse primers, kunnen de primers niet-specifiek aan verschillende doelen binden, waardoor de specificiteit afneemt en mogelijke fout-positieve resultaten toenemen.

De gloeitemperatuur (Tm) is een cruciale factor voor het bepalen van de specificiteit / nauwkeurigheid van de qPCR-procedure en essentieel voor het evalueren van de nauwkeurigheid van qPCR-protocollen. Aanbeveling voor beste praktijken: beide primers (vooruit en achteruit) moeten een bijna vergelijkbare waarde hebben, bij voorkeur dezelfde waarde.

We gebruikten de vrij verkrijgbare primer-ontwerpsoftware Primer-BLAST [12, 25] om de best-practice-waarden te evalueren voor alle primers die in het Corman-Drosten-document worden gebruikt (tabel 3). We hebben geprobeerd een Tm-waarde van 60 ° C te vinden, terwijl we op dezelfde manier de hoogst mogelijke GC% -waarde voor alle primers zochten. Een maximaal Tm-verschil van 2 ° C binnen primerparen werd aanvaardbaar geacht. Bij het testen van de primerparen gespecificeerd in het Corman-Drosten-document, zagen we een verschil van 10 ° C met betrekking tot de gloeitemperatuur Tm voor primerpaar1 (RdRp_SARSr_F en RdRp_SARSr_R). Dit is een zeer ernstige fout en maakt het protocol onbruikbaar als specifiek diagnostisch hulpmiddel.

Aanvullende testen toonden aan dat alleen het primerpaar ontworpen om het N-gen te amplificeren (N_Sarbeco_F en N_Sarbeco_R) de geschikte standaard bereikte om in een diagnostische test te werken, aangezien het een voldoende GC-gehalte heeft en het Tm-verschil tussen de primers (N_Sarbeco_F en N_Sarbeco_R ) is 1,85 ° C (onder het cruciale maximum van 2 ° C verschil). Belangrijk is dat dit het gen is dat niet werd getest in de virusmonsters (Tabel 2) en ook niet werd benadrukt als een bevestigende test. Naast zeer variabele smelttemperaturen en gedegenereerde sequenties in deze primers, is er nog een andere factor die de specificiteit van de procedure beïnvloedt: de dNTP’s (0,4 uM) zijn 2x hoger dan aanbevolen voor een zeer specifieke amplificatie. Er wordt ook extra magnesiumsulfaat aan de reactie toegevoegd. Deze procedure gecombineerd met een lage gloeitemperatuur kan niet-specifieke amplificaties creëren. Als extra magnesium nodig is voor qPCR, moet de specificiteit van de test verder worden onderzocht.

De hier beschreven ontwerpfouten zijn zo ernstig dat het hoogst onwaarschijnlijk is dat specifieke amplificatie van genetisch materiaal van SARS-CoV-2 zal plaatsvinden met behulp van het protocol van het Corman-Drosten-document.

Tabel 3: GC-inhoud van de primers en sondes (overgenomen van Corman-Drosten-papier; afwijkingen van geoptimaliseerde GC-inhoud zijn gemarkeerd. Tweede paneel toont een tabel met alle Primer-BLAST-best practices-waarden voor alle primers en sondes die in het Corman-Drosten-document van prof. dr. Ulrike Kämmerer en haar team

3. Het aantal amplificatiecycli

Opgemerkt moet worden dat er nergens in het Corman-Drosten-artikel wordt vermeld dat een test positief of negatief is, of zelfs wat een positief of negatief resultaat definieert. Dit soort virologische diagnostische tests moet gebaseerd zijn op een SOP, inclusief een gevalideerd en vast aantal PCR-cycli (Ct-waarde) waarna een monster als positief of negatief wordt beschouwd. De maximale redelijk betrouwbare Ct-waarde is 30 cycli. Boven een Ct van 35 cycli moeten snel toenemende aantallen fout-positieven worden verwacht.

PCR-gegevens die als positief worden beoordeeld na een Ct-waarde van 35 cycli, zijn volkomen onbetrouwbaar.

Onder verwijzing naar Jaafar et al. 2020 [3]: “Bij Ct = 35, de waarde die we gebruikten om een ​​positief resultaat voor PCR te rapporteren, is <3% van de culturen positief.” Met andere woorden, er was geen succesvolle virusisolatie van SARS-CoV-2 bij die hoge Ct-waarden.

Verder tonen wetenschappelijke studies aan dat alleen niet-infectieuze (dode) virussen worden gedetecteerd met Ct-waarden van 35 [22].

Tussen 30 en 35 is er een grijs gebied, waar een positieve test niet met zekerheid kan worden vastgesteld. Dit gebied moet worden uitgesloten. Je zou natuurlijk 45 PCR-cycli kunnen uitvoeren, zoals aanbevolen in het Corman-Drosten WHO-protocol (Figuur 4), maar dan moet je ook een redelijke Ct-waarde definiëren (die niet hoger mag zijn dan 30). Maar een analytisch resultaat met een Ct-waarde van 45 is wetenschappelijk en diagnostisch absoluut zinloos (een redelijke Ct-waarde mag niet hoger zijn dan 30). Dit alles moet heel duidelijk worden gecommuniceerd. Het is een grote vergissing dat het Corman-Drosten-artikel niet de maximale Ct-waarde vermeldt waarbij een monster ondubbelzinnig als een positief of negatief testresultaat kan worden beschouwd. Deze belangrijke drempelwaarde voor de cyclus wordt tot op heden ook niet gespecificeerd in vervolginzendingen.

Figuur 4: Aanbeveling RT-PCR Kit in het officiële Corman-Drosten WHO-protocol [8]. Alleen een “Cycler” -waarde (cycli) is te vinden zonder overeenkomstige en wetenschappelijk redelijke Ct (Cutoff-waarde). Deze of enige andere cycluswaarde is nergens te vinden in het eigenlijke Corman-Drosten-document.

4. Biomoleculaire validaties

Om te bepalen of de geamplificeerde producten inderdaad SARS-CoV-2-genen zijn, is biomoleculaire validatie van geamplificeerde PCR-producten essentieel. Voor een diagnostische test is deze validatie een absolute must.

Validatie van PCR-producten moet worden uitgevoerd door ofwel het PCR-product in een 1% agarose-EtBr-gel te laten lopen, samen met een maatindicator (DNA-liniaal of DNA-ladder) zodat de grootte van het product kan worden geschat. De grootte moet overeenkomen met de berekende grootte van het amplificatieproduct. Maar het is nog beter om het amplificatieproduct te sequencen. Dit laatste geeft 100% zekerheid over de identiteit van het amplificatieproduct. Zonder moleculaire validatie kan men niet zeker zijn van de identiteit van de geamplificeerde PCR-producten. Gezien de ernstige ontwerpfouten die eerder zijn beschreven, kunnen de versterkte PCR-producten van alles zijn.

Ook niet genoemd in het Corman-Drosten-artikel is het geval van kleine fragmenten van qPCR (ongeveer 100 bp): het kan ofwel 1,5% agarosegel zijn of zelfs een acrylamidegel.

Het feit dat deze PCR-producten niet op moleculair niveau zijn gevalideerd, is een andere opvallende fout van het protocol, waardoor elke daarop gebaseerde test nutteloos is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

5. Positieve en negatieve controles om specifieke virusdetectie te bevestigen / weerleggen.

De onbevestigde veronderstelling die in het Corman-Drosten-artikel wordt beschreven, is dat SARS-CoV-2 het enige virus is uit de SARS-achtige bètacoronavirusgroep dat momenteel infecties bij mensen veroorzaakt. De sequenties waarop hun PCR-methode is gebaseerd, zijn in silico-sequenties, geleverd door een laboratorium in China [23], omdat op het moment van ontwikkeling van de PCR-test geen controlemateriaal van infectieus (“levend”) of geïnactiveerd SARS-CoV- 2 was beschikbaar voor de auteurs. De PCR-test is daarom ontworpen met behulp van de sequentie van het bekende SARS-CoV als controlemateriaal voor de Sarbeco-component (Dr. Meijer, co-auteur Corman-Drosten-paper in een e-mailuitwisseling met Dr. Peter Borger) [2].

Van alle personen die positief testen met de RT-PCR-test, zoals beschreven in het Corman-Drosten-artikel, wordt aangenomen dat ze positief zijn voor SARS-CoV-2-infecties. Er zijn drie ernstige tekortkomingen in hun aanname. Ten eerste kan een positieve test voor de RNA-moleculen die in het Corman-Drosten-document worden beschreven, niet worden gelijkgesteld aan “infectie met een virus”. Een positieve RT-PCR-test geeft alleen de aanwezigheid van virale RNA-moleculen aan. Zoals aangetoond onder punt 1d (hierboven), was de Corman-Drosten-test niet ontworpen om het virus van volledige lengte te detecteren, maar slechts een fragment van het virus. We concludeerden al dat dit de test als ongeschikt kwalificeert als diagnostische test
voor SARS-virusinfecties.

Ten tweede en van groot belang is dat de functionaliteit van de gepubliceerde RT-PCR-test niet werd aangetoond met het gebruik van een positieve controle (geïsoleerd SARS-CoV-2 RNA), wat een essentiële wetenschappelijke gouden standaard is.

Ten derde stelt de Corman-Drosten-paper:

“Om aan te tonen dat de assays andere vleermuis-geassocieerde SARS-gerelateerde virussen kunnen detecteren, hebben we de E-genassay gebruikt om zes vleermuis-afgeleide ontlastingsmonsters te testen die verkrijgbaar zijn bij Drexler et al. […] En Muth et al. […]. Deze viruspositieve monsters waren afkomstig van Europese rhinolofide vleermuizen. Detectie van deze fylogenetische uitschieters binnen de SARS-gerelateerde CoV-clade suggereert dat alle Aziatische virussen waarschijnlijk zullen worden gedetecteerd. Dit zou theoretisch een brede gevoeligheid garanderen, zelfs in het geval van meerdere onafhankelijke acquisities van variantvirussen uit een dierlijk reservoir. “

Deze verklaring toont aan dat het E-gen dat wordt gebruikt in RT-PCR-test, zoals beschreven in het Corman-Drosten-artikel, niet specifiek is voor SARS-CoV-2.

De E-genprimers detecteren ook een breed spectrum van andere SARS-virussen.
Het genoom van het coronavirus is het grootste van alle RNA-virussen die mensen infecteren en ze hebben allemaal een zeer vergelijkbare moleculaire structuur. Toch hebben SARS-CoV1 en SARS-CoV-2 twee zeer specifieke genetische vingerafdrukken, waardoor ze zich onderscheiden van de andere coronavirussen. Ten eerste is een unieke vingerafdruksequentie (KTFPPTEPKKDKKKK) aanwezig in het N-eiwit van SARS-CoV en SARS-CoV-2 [13,14,15]. Ten tweede bevatten zowel SARS-CoV1 als SARS-CoV2 niet het HE-eiwit, terwijl alle andere coronavirussen dit gen bezitten [13, 14].Dus om specifiek een SARS-CoV1- en SARS-CoV-2-PCR-product te detecteren, had het bovenstaande gebied in het N-gen als het amplificatiedoel moeten worden gekozen. Een betrouwbare diagnostische test zou zich als bevestigende test op dit specifieke gebied in het N-gen moeten richten. De PCR voor dit N-gen werd niet verder gevalideerd of aanbevolen als testgen door het Drosten-Corman-document, omdat het “niet zo gevoelig” was met de originele SARS-CoV-sonde [1].

Bovendien maakt de afwezigheid van het HE-gen in zowel SARS-CoV1 als SARS-CoV-2 dit gen de ideale negatieve controle om andere coronavirussen uit te sluiten. Het papier van Corman-Drosten bevat deze negatieve controle niet, noch bevat het andere negatieve controles.De PCR-test in het artikel van Corman-Drosten bevat daarom noch een unieke positieve controle, noch een negatieve controle om de aanwezigheid van andere coronavirussen uit te sluiten. Dit is een andere belangrijke ontwerpfout die de test als ongeschikt voor diagnose classificeert.

6. Standard Operational Procedure (SOP) is niet beschikbaar

Er dient een Standard Operational Procedure (SOP) beschikbaar te zijn, die de bovenstaande parameters ondubbelzinnig specificeert, zodat alle laboratoria in staat zijn dezelfde testcondities op te zetten. Het hebben van een gevalideerde universele SOP is essentieel, omdat het gegevensvergelijking binnen en tussen landen mogelijk maakt. Het is erg belangrijk om alle primerparameters eenduidig ​​te specificeren. We merken op dat dit niet is gebeurd.Verder wordt de Ct-waarde die aangeeft wanneer een monster als positief of negatief moet worden beschouwd, niet gespecificeerd. Het wordt ook niet gespecificeerd wanneer een monster als geïnfecteerd met SARS-CoV-virussen wordt beschouwd. Zoals hierboven is aangetoond, kan de test geen onderscheid maken tussen virus- en virusfragmenten, dus de Ct-waarde die positiviteit aangeeft, is van cruciaal belang. Deze Ct-waarde had in de Standard Operational Procedure (SOP) gespecificeerd moeten zijn en online gezet moeten worden zodat alle laboratoria die deze test uitvoeren exact dezelfde randvoorwaarden hebben. Het wijst op gebrekkige wetenschap dat een dergelijke SOP niet bestaat. Het staat de laboratoria dus vrij om de test naar eigen inzicht uit te voeren, wat resulteert in enorm veel variatie. Laboratoria in heel Europa blijven met een veelheid aan vragen zitten; welke primers te bestellen? welke nucleotiden moeten de ongedefinieerde plaatsen worden ingevuld? welke Tm-waarde moet ik kiezen? Hoeveel PCR-cycli moeten er worden uitgevoerd? Bij welke Ct-waarde is het monster positief? En wanneer is het negatief? En hoeveel genen moeten we testen? Moeten alle genen worden getest, of alleen het E- en RpRd-gen zoals weergegeven in Tabel 2 van het Corman-Drosten-document? Moet het N-gen ook worden getest? En wat is hun negatieve controle? Wat is hun positieve controle?

Het protocol zoals beschreven is helaas erg vaag en foutief in zijn ontwerp dat men in tientallen verschillende richtingen kan gaan. Er lijkt geen standaardisatie of SOP te zijn, dus het is niet duidelijk hoe deze test kan worden geïmplementeerd.

7. Gevolgen van de fouten beschreven onder 1-5: fout-positieve resultaten.

De RT-PCR-test die wordt beschreven in het Corman-Drosten-artikel bevat zoveel moleculair biologische ontwerpfouten (zie 1-5) dat het niet mogelijk is om eenduidige resultaten te verkrijgen. Het is onvermijdelijk dat deze test een enorm aantal zogenaamde “false positives” zal genereren. De definitie van fout-positieven is een negatief monster, dat aanvankelijk positief scoort, maar negatief is na opnieuw testen met dezelfde test. Valse positieven zijn foutieve positieve testresultaten, dwz negatieve monsters die positief testen. En dit is inderdaad wat er in de Corman-Drosten-paper staat. Op pagina 6 van de manuscript-pdf laten de auteurs zien dat zelfs onder goed gecontroleerde laboratoriumomstandigheden een aanzienlijk percentage fout-positieven wordt gegenereerd met deze test:

“In vier individuele testreacties werd een zwakke initiële reactiviteit gezien, maar ze waren negatief bij opnieuw testen met dezelfde assay. Deze signalen waren niet geassocieerd met een bepaald virus, en voor elk virus waarmee aanvankelijke positieve reactiviteit optrad, waren er andere monsters die hetzelfde virus in een hogere concentratie bevatten maar niet positief testten. Gezien de resultaten van de uitgebreide technische kwalificatie die hierboven is beschreven, werd geconcludeerd dat deze aanvankelijke reactiviteit niet te wijten was aan chemische instabiliteit van real-time PCR-sondes en hoogstwaarschijnlijk aan behandelingsproblemen die werden veroorzaakt door de snelle introductie van nieuwe diagnostische tests en controles tijdens deze evaluatie. studie.” [1]

De eerste zin van dit fragment is een duidelijk bewijs dat de PCR-test die wordt beschreven in de Corman-Drosten-paper valse positieven genereert. Zelfs onder de goed gecontroleerde omstandigheden van het ultramoderne Charité-laboratorium zijn 4 van de 310 primaire tests per definitie fout-positieven. Vier negatieve monsters testten aanvankelijk positief en waren vervolgens negatief bij opnieuw testen. Dit is het klassieke voorbeeld van een vals positief. In dit geval identificeren de auteurs ze niet als valse positieven, wat intellectueel oneerlijk is.

Een andere veelbetekenende observatie in het bovenstaande fragment is dat de auteurs de valse positieven wegredeneren als “afhandelingsproblemen veroorzaakt door de snelle introductie van nieuwe diagnostische tests”. Stel je de laboratoria voor die de test moeten invoeren zonder alle noodzakelijke informatie die normaal in een SOP wordt beschreven.

8. De paper van Corman-Drosten werd niet door vakgenoten beoordeeld

Voordat ze officieel in een wetenschappelijk tijdschrift worden gepubliceerd, worden wetenschappelijke en medische artikelen traditioneel gecertificeerd door ‘peer review’. In dit proces nemen de redacteuren van het tijdschrift advies in van verschillende experts (“referenten”) die het artikel hebben beoordeeld en kunnen zij zwakke punten in de aannames, methoden en conclusies identificeren. Gewoonlijk publiceert een tijdschrift pas een artikel als de redactie ervan overtuigd is dat de auteurs de zorgen van de referenten hebben aangepakt en dat de gepresenteerde gegevens de conclusies in de paper ondersteunen. ” Dit proces wordt ook goed beschreven voor Eurosurveillance [16].

De paper van Corman-Drosten werd op 21 januari 2020 bij Eurosurveillance ingediend en op 22 januari 2020 geaccepteerd voor publicatie. Op 23 januari 2020 stond de paper online. Op 13 januari 2020 werd versie 1-0 van het protocol gepubliceerd op de officiële WHO-website [17], bijgewerkt op 17 januari 2020 als documentversie 2-1 [18], zelfs voordat de Corman-Drosten-paper op 23 januari werd gepubliceerd op Eurosurveillance.

Normaal gesproken is peer review een tijdrovend proces aangezien minstens twee experts uit het veld de ingediende paper kritisch moeten lezen en becommentariëren. Naar onze mening is dit artikel niet door vakgenoten beoordeeld. Vierentwintig uur zijn simpelweg niet genoeg om een ​​grondige peer review uit te voeren. Onze conclusie wordt ondersteund door het feit dat we een enorm aantal zeer ernstige ontwerpfouten hebben gevonden, die de PCR-test volkomen ongeschikt maken als diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren. Elke moleculair bioloog die bekend is met RT-PCR-ontwerp, zou gemakkelijk de ernstige fouten in het Corman-Drosten-document hebben waargenomen vóór het eigenlijke beoordelingsproces. We hebben Eurosurveillance op 26 oktober 2020 gevraagd om ons een kopie van het peer review rapport te sturen. Dit rapport hebben wij tot op heden niet ontvangen en bij brief van 18 november 2020, het ECDC als gastheer voor Eurosurveillance weigerde toegang te verlenen zonder substantiële wetenschappelijke redenen voor hun besluit op te geven. Integendeel, ze schrijven dat “openbaarmaking het doel van wetenschappelijk onderzoek zou ondermijnen”. [24].

9. Auteurs als redacteuren

Een laatste punt is een punt van grote zorg. Het blijkt dat twee auteurs van de Corman-Drosten-paper, Christian Drosten en Chantal Reusken, ook lid zijn van de redactie van dit tijdschrift [19]. Daarom is er een ernstig belangenconflict dat het vermoeden versterkt dat de paper niet door vakgenoten is beoordeeld. Het lijkt erop dat de snelle publicatie mogelijk was simpelweg omdat de auteurs ook deel uitmaakten van de redactie van Eurosurveillance. Deze praktijk wordt gecategoriseerd als een aantasting van de wetenschappelijke integriteit.

SAMENVATTING CATALOGUS VAN FOUTEN IN HET PAPIER

Het document van Corman-Drosten bevat de volgende specifieke fouten:

1. Er bestaat geen gespecificeerde reden om deze extreem hoge concentraties primers in dit protocol te gebruiken. De beschreven concentraties leiden tot verhoogde niet-specifieke bindingen en PCR-productamplificaties, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

2. Zes niet-gespecificeerde wiebelige posities zullen een enorme variabiliteit introduceren in de praktische laboratoriumimplementaties van deze test; de verwarrende niet-specifieke beschrijving in het Corman-Drosten-artikel is niet geschikt als een standaard operationeel protocol, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

3. De test kan geen onderscheid maken tussen het hele virus en virale fragmenten. Daarom kan de test niet worden gebruikt als diagnose voor intacte (besmettelijke) virussen, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren en conclusies te trekken over de aanwezigheid van een infectie.

4. Een verschil van 10 ° C met betrekking tot de uitgloeitemperatuur Tm voor primerpaar1 (RdRp_SARSr_F en RdRp_SARSr_R) maakt de test ook ongeschikt als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

5. Een ernstige fout is het weglaten van een Ct-waarde waarbij een steekproef als positief en negatief wordt beschouwd. Deze Ct-waarde wordt ook niet gevonden in vervolginzendingen, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

6. De PCR-producten zijn niet gevalideerd op moleculair niveau. Dit feit maakt het protocol onbruikbaar als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

7. De PCR-test bevat noch een unieke positieve controle om de specificiteit voor SARS-CoV-2 te evalueren, noch een negatieve controle om de aanwezigheid van andere coronavirussen uit te sluiten, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om de SARS-CoV-2 te identificeren. virus.

8. Het testontwerp in het Corman-Drosten-document is zo vaag en gebrekkig dat je in tientallen verschillende richtingen kunt gaan; niets is gestandaardiseerd en er is geen SOP. Dit stelt de wetenschappelijke validiteit van de test ten zeerste ter discussie en maakt het ongeschikt als specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

9. Hoogstwaarschijnlijk is het artikel van Corman-Drosten niet door vakgenoten beoordeeld, waardoor de test ongeschikt is als een specifiek diagnostisch hulpmiddel om het SARS-CoV-2-virus te identificeren.

10. We vinden ernstige belangenconflicten bij ten minste vier auteurs, naast het feit dat twee van de auteurs van het Corman-Drosten-artikel (Christian Drosten en Chantal Reusken) lid zijn van de redactie van Eurosurveillance. Een belangenconflict werd toegevoegd op 29 juli 2020 (Olfert Landt is CEO van TIB-Molbiol; Marco Kaiser is senior onderzoeker bij GenExpress en dient als wetenschappelijk adviseur voor TIB-Molbiol), dat niet werd verklaard in de originele versie (en nog steeds is ontbreekt in de PubMed-versie); TIB-Molbiol is het bedrijf dat “de eerste” was die PCR-kits (Light Mix) produceerde op basis van het protocol gepubliceerd in het Corman-Drosten-manuscript, en volgens hun eigen woorden verspreidden ze deze PCR-testkits voordat de publicatie werd gepubliceerd. zelfs ingediend [20]; verder, Victor Corman & Christian Drosten heeft hun tweede affiliatie niet genoemd: het commerciële testlaboratorium “Labor Berlin”. Beiden zijn verantwoordelijk voor de virusdiagnostiek daar [21] en het bedrijf is actief op het gebied van real-time PCR-testen.

In het licht van ons heronderzoek van het testprotocol om SARS-CoV-2 te identificeren, beschreven in het Corman-Drosten-document, hebben we fouten en inherente drogredenen geïdentificeerd die de SARS-CoV-2 PCR-test onbruikbaar maken.

CONCLUSIE

De beslissing welke testprotocollen worden gepubliceerd en algemeen beschikbaar worden gesteld, ligt volledig in handen van Eurosurveillance. Een beslissing om de fouten in het document van Corman-Drosten te erkennen, heeft het voordeel dat de menselijke kosten en het lijden in de toekomst aanzienlijk worden geminimaliseerd.

Is het niet in het belang van Eurosurveillance om dit document in te trekken? Onze conclusie is duidelijk. In het licht van alle enorme ontwerpfouten en fouten van het PCR-protocol die hier worden beschreven, concluderen we: er is niet veel keuze meer in het kader van wetenschappelijke integriteit en verantwoordelijkheid.

REFERENTIES

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detectie van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) door realtime RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] E-mailcommunicatie tussen dr. Peter Borger en dr. Adam Meijer: aanvullend materiaal

[3] Jafaar et al., Correlatie tussen 3790 kwantitatieve polymerasekettingreactie-positieve monsters en positieve celkweken, met inbegrip van 1941 ernstig acuut respiratoir syndroom, coronavirus 2-isolaten. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21 januari 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;
Archief: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics – COVID19-sterfgevallen wereldwijd: https://bit.ly/3fndemJ
Archief: https://archive.is/PpqEE

[6] Laboratoriumtests voor COVID-19 Emergency Response Technical Center, NIVD onder
China CDC 15 maart 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Real-Time PCR-handboek Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf

Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Gids voor goede praktijken voor de toepassing van kwantitatieve PCR (qPCR) Eerste editie 2013

[8] Trestan Pillonel et al, Brief aan de redactie: SARS-CoV-2 detectie door real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu en David WG Brown. “Moleculaire diagnostische technieken.” Geneeskunde 38.10
(2009): 535-540.

[10] Wolfel et al., Virologische beoordeling van gehospitaliseerde patiënten met COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Webtool Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biologyocation-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Aanvullend materiaal

[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Wetenschap. De
genoomsequentie van het SARS-geassocieerde coronavirus. Wetenschap 300 (5624): 1399-1404.

[14] Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 isolaat Wuhan-Hu-1, compleet
genoom: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. Een SARS-achtig Coronavirus werd verwacht, maar er werd niets gedaan om voorbereid te zijn. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared
 ;
Archief: https://archive.is/i76Hu

[16] Evaluatie- / herzieningsproces van Eurosurveillance-paper: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Officiële aanbeveling van het Corman-Drosten-protocol en -manuscript door de WHO, gepubliceerd op 13 januari 2020 als versie 1.0 van het document:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf
 ; archief: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Officiële WHO-aanbeveling voor het Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, die
rechtstreeks is afgeleid van de Eurosurveillance-publicatie, documentversie 2-1, gepubliceerd op
17 januari 2020: https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-v2-
1.pdf? sfvrsn = a9ef618c_2

[19] Redactieraad van Eurosurveillance, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets / imgs / 2020-09-Editorial% 20Board% 20PDF.pdf
 ;
Archief: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Gebruiksaanwijzing LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11 januari 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gen_V200204_09164154001 (1 ) .pdf

Archief, tijdstempel – 11 januari 2020: https://archive.is/Vulo5 ;
Archief: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten & Victor Corman, verantwoordelijk voor virale diagnostiek bij Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archief: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Virale culturen voor beoordeling van COVID-
19-infectiviteit. Systematische herziening. Systematische review doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al., The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] Antwoord van het ECDC aan dr. Peter Borger, 18 november 2020:
aanvullend materiaal

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, onderzoek & Primer-BLAST-tabel:
aanvullend materiaal

Aanvullende literatuur:

Beschrijving RT-PCR RKI Duitsland, op pagina 10 van deze link:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
? DownloadsJ / JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf __ blob = p
ublicationFile

Aansluitingen van de auteur :

1) Dr.Pieter Borger (MSc, PhD), Moleculaire Genetica, W + W Research Associate, Lörrach, Duitsland
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra ), voormalig 3D-kunstenaar / wetenschappelijke visualisaties bij CeMM – Centrum voor Moleculaire Geneeskunde van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen (2019-2020), Universiteit voor Toegepaste Kunsten – Afdeling voor Digitale Kunst Wenen, Oostenrijk
3) Dr. Michael Yeadon BSs (Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Farmacologie U Surrey. Managing Director, Yeadon Consulting Ltd, voormalig Pfizer Chief Scientist, Verenigd Koninkrijk
4) Dr.Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Verenigd Koninkrijk
5) Kevin McKernan , BS Emory University, Chief Scientific Officer, oprichter Medical Genomics, ontwierp de sequencing-pijplijn bij WIBR / MIT voor het Human Genome Project, bedacht en ontwikkelde de SOLiD-sequencer, bekroonde patenten met betrekking tot PCR, DNA-isolatie en sequencing, VS.
6) Prof.Dr.Klaus Steger , Afdeling Urologie, Pediatrische Urologie en Andrologie, Moleculaire Andrologie, Biomedisch Onderzoekscentrum van de Justus Liebig Universiteit, Giessen, Duitsland
7) Dr.Paul McSheehy (BSc, PhD), biochemicus en farmacoloog uit de industrie, Loerrach, Duitsland
8) Dr.Lidiya Angelova , MSc in biologie, PhD in microbiologie, voormalig onderzoeker bij het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, VS.
9) Dr. Fabio Franchi , voormalig Dirigente Medico (MD) in een afdeling infectieziekten, gespecialiseerd in “Infectieziekten” en “Hygiëne en preventieve geneeskunde”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italië
10) Dr. med. Thomas Binder, internist en cardioloog (FMH), Zwitserland
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialist Diagnostische Radiologie, Hoofdarts van het Centrum voor Radiologie van het Collm Oschatz-Ziekenhuis, Duitsland
12) Prof.Dr.Makoto Ohashi , emeritus hoogleraar, PhD in microbiologie en immunologie, Tokushima University, Japan
13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., microbioloog, voedingsdeskundige, Italië
14) Dr.Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialist in laboratoriumgeneeskunde (klinische chemie), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Nederland
15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Milieuchemie en toxicologie. DGI Consulting Services, Oslo, Noorwegen
16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Afdeling Stralingsoncologie, Leopoldina Ziekenhuis Schweinfurt, Duitsland
17) Dr.Ruth Schruefer, PhD, menselijke genetica / immunologie, München, Duitsland,
18) Dra. Berber W. Pieksma, huisarts, Nederland
19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Consultant Neuroloog, Nederland
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (moleculair bioloog), IP-specialist, BDC Basel, Zwitserland
21) Dr.Kevin P. Corbett , MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) Londen, Engeland, Verenigd Koninkrijk
22) Prof.Dr.Ulrike Kämmerer, specialist in virologie / immunologie / menselijke biologie / celbiologie, Universitair Ziekenhuis Würzburg, Duitsland

Bijdragen van de auteur:

PB: heeft de analyses en het onderzoek gepland en uitgevoerd en het manuscript geconceptualiseerd.
BRM: heeft het onderzoek gepland en uitgevoerd en de figuren en het manuscript geconceptualiseerd.
MY: voerde de analyses en het onderzoek uit.
KMcK: voerde de analyses en het onderzoek uit, bedacht het manuscript.
KS: voerde de analyses en het onderzoek uit.
PMcS: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
LA: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
FF: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
TB: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
HU: proeflezen van de analyses en het onderzoek.
MO: Proeflezen van de analyses en het onderzoek.
SS: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
MDvK: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
DG: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
RJK: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
RS: Proeflezen van de analyses en het onderzoek, en het manuscript.
BWK: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
RvV: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
JB: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
KC: Proeflezen van de analyses en onderzoeken.
UK: heeft de analyses en het onderzoek gepland en uitgevoerd, waarbij het manuscript is geconceptualiseerd.

Extra proeflezers:

Saji N Hameed, Milieu-informatica, Universiteit van Aizu, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima, Japan
Howard R. Steen, MA Chem. Eng. Cantab, voormalig onderzoeksmanager, Duitsland

Bron: https://www.stoppfizer.org

(Help ons. Deel dit artikel a.u.b.)

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *

een × drie =

Deze website gebruikt Akismet om spam te verminderen. Bekijk hoe je reactie-gegevens worden verwerkt.